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CO2培养箱的污染控制
CO2培养箱的污染控制
图 1 神经元 图 2 红细胞 图 3人卵子
CO2培养箱通过对温度、湿度和CO2浓度的控制,为细胞、组织的体外培养提供稳定的培养环境。广泛应用于哺乳动物细胞培养,常见于细胞动力学研究、哺乳动物细胞分泌物的收集、各种物化因素的致癌或毒理效应、抗原的研究和生产、培养杂交瘤细胞生产抗体、体外授精、iPS可诱导性干细胞等研究领域。
在生物活体内,生物体有自身的免疫系统保护细胞或组织,但是在体外培养时,没有任何保护自己的免疫屏障。对于培养箱的基本参数温度、湿度和CO2浓度,大多数培养箱都能满足研究需要。然而,针对培养过程中细胞面临的各种污染物,各类培养箱的控制方式和效果不尽相同,因此细胞体外培养中最大的威胁实际上是污染问题。
CO2培养箱中的主要污染源:细菌、真菌(霉菌和酵母菌)、病毒、支原体(图4-7)。
图 4细菌 图 5病毒 图 6 霉菌 图 7 支原体
对于细胞来说,非常理想的培养环境同样也适合这些污染物的生存,培养箱本身是不会辨别的,而细胞培养中80%-90%的时间细胞都是位于培养箱内,因此箱内能否抑菌或灭菌非常关键!
细菌:细菌污染后,培养基1-2天就会变色,应迅速将污染细胞与其它细胞系隔离,灭菌后丢弃,还要用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台,检查HEPA过滤器。
病毒:由于病毒寄生生存,爆发后尽快和正常细胞隔离,丢弃处理,相对来说容易处理,但是对操作者威胁较大。
真菌(霉菌和酵母菌):目前没有好的抑制方法,包括现在常用的两性霉素,一旦污染容易反复爆发,因为孢子很难杀灭。
支原体:支原体污染后,因为它们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存,培养基一般不发生浑浊,细胞无明显变化,外观上给人以正常感觉,实则细胞已经受到多方面潜在影响,如引起细胞变形,影响DNA合成,抑制细胞生长等。
因此,这些感染一旦发生,细胞最后基本只能丢弃,无法挽回,对于很多取样困难的实验损失无法估量!
目前,CO2培养箱的灭菌方式主要为干热、湿热、紫外灯照射、消毒剂擦拭等。
高温干热灭菌是公认的有效的灭菌方式;当然,湿热灭菌在长时间条件下也可以达到很好的灭菌效果,但是现在市面上湿热灭菌的箱体很少;紫外灯照射法的有效性受很多因素影响,如遮挡、时间、强度、照射距离,湿度等,灭菌效果很难保证;消毒剂擦拭法是对表面灭菌的方法,适合于平整的表面如实验台面,而箱体内部设计的死角、各种器件因无法擦拭等因素导致灭菌效果也很有限,而且含氯、碘的消毒剂对于不锈钢有腐蚀作用,不能对不锈钢箱体进行擦拭灭菌。
美国Thermo 8000CO2培养箱是现今市面上高品质培养箱的代表之作,它采用140℃120min高温干热灭菌,保证能够杀死箱体表面所有的微生物和真菌孢子(图8)。
图 8 美国Thermo 8000 CO2培养箱 140℃120min干热高温灭菌
在箱体的设计上,美国Thermo 8000 CO2培养箱也从多方面进行了抑菌设计:
1) 内壁采用抛光不锈钢内壁(图9),研究显示抛光不锈钢能够明显降低污染物的生长;
图 9 不锈钢抛光内壁 圆角设计
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