腺病毒体外在293细胞中大量扩增的方法

在293细胞中大量扩增腺病毒

一旦重组病毒已被纯化和鉴定，即可在293细胞中进行大量扩增。本手册提供了递增培养规模和腺病毒感染周期的基本方法，按这一方法最终得到的病毒量约为3×10¹¹～3×10¹²。由于一个细胞中所含的病毒颗粒为1000～10000，因此1L 培养细胞可得到约5×10¹²病毒颗粒。如果要把病毒用氯化铯梯度离心纯化，则必须至少3×10⁸的细胞，这样才能正确分辨出病毒带。对于蛋白表达，则根据需要可在任何一步扩增步骤中停止，离心沉淀细胞后按照适当的操作方法进行蛋白抽提（根据蛋白类型的不同抽提上清或细胞沉淀）。为优化时间进程，每个感染周期必须与下一次细胞扩增培养同步。如果由于各种原因不能同步，则必须将病毒冻存，直至下一次细胞培养开始后再融化病毒。注意每次扩增都将会剩下一些病毒，这些病毒先不必丢弃，以便下一步扩增失败时备用。每次扩增最好都用最低代的病毒颗粒，这样产生突变型病毒的可能性会大大降低。

操作步骤：

1 在100mm 培养皿或75cm² 培养瓶中加入10mlDMEM5%培养5×10⁶ 293 细胞。

2 取0.5ul 首次扩增的病毒保存液，加入DMEM5%至1ml，混匀，这样稀释得到的MOI 值约为5。

3 移去培养液，小心加入病毒混合液，切勿破坏细胞单层，十字形慢慢晃动3 次，37℃ CO2 孵箱中培养90 分钟。

4 加入9ml DMEM5%。

5 再培养72 小时，这时在10ml 溶液中大约有5×10⁹～5×10¹⁰个病毒颗粒，进行MOI 测定以估计病毒颗粒。

注：如果此时得到的病毒量已足够，可立即进行病毒滴度测定。收集细胞，600×g 离心5分钟沉淀细胞，去上清后加入最小体积（一般为原始体积的1/10 即1ml）病毒保存溶液重悬细胞。-20⁰C/37⁰C 冻融3 次，台式离心机上以最大速率离心去除细胞碎片，收集上清，然后进行病毒滴定。

1  -20℃/37℃冻融3 次。

2转入15ml 无菌离心管中，台式离心机上以最大速率离心10 分钟，收集上清冻存于-20 ℃或-80 ℃。

3  3 个175cm² 培养瓶中各加入10⁷ 293细胞进行培养。

4  将3ml 细胞裂解液上清加入12ml DMEM5%中，混匀。移去细胞培养液，每瓶小心加入5ml混合液，十字形慢慢晃动混匀3 次，37⁰C 5%CO2 孵箱中培养90 分钟。此时MOI 值约为25。

5 加入DMEM5%至30ml。

6 再培养48～72 小时。此时10ml培养液病毒量约为3×10¹⁰～3×10¹¹。若需要，进行MOI 测定以估计病毒滴度。

注：如果此时病毒量已可以满足实验所需，则可立即进入病毒滴定步骤。600×g 离心5 分钟收集细胞，弃上清，加入1/10原始体积的溶液重悬细胞。-20⁰C /37⁰C 冻融3次，台式离心机上以最大速率沉淀细胞碎片，收集上清，进行病毒滴定。

12. 移入50ml 离心管中，台式离心机上最大速率离心10 分钟，取出上清保存。

13. 30 瓶175 cm2 培养瓶中每瓶各加入10⁷ 293 细胞。

14. 将45ml 细胞裂解液上清加入105ml DMEM5%混匀，从培养瓶中移去培养液，加入5ml混合液感染细胞，十字形缓慢晃动3 次混匀，370C 培养90 分钟。此时MOI 值约为25。

15. 加入DMEM5%至30ml/瓶。

16. 再培养48-72 小时，此时约有3×10¹¹～3×10¹²个病毒。若需要，进行MOI 测定估计病毒滴度。

如果要收集病毒颗粒，先收集被感染细胞，然后重悬在5ml DMEM5%中。-20⁰C/37⁰C 冻融3 次，离心沉淀细胞碎片。此时5mlDMEM5%中3×10¹¹～3×10¹²个病毒颗粒，浓度为6×10¹⁰～6×10¹¹vp/ml。然后测定病毒滴度，或者用标准的氯化铯密度梯度离心法纯化病毒。

在109 细胞中扩增病毒可获得大量病毒保存液，而在1010细胞中扩增则有一定技术性。切勿将扩增后的病毒保存液再用来感染细胞，因这会大大增加RCA产生量。有时不得不使用纯化空斑以最大可能降低RCA产量。如果已没有纯化的空斑，那么就不得不重新空斑纯化重组病毒，鉴定克隆后再进行扩增。如果需要大于扩增4轮后的病毒量，注意请用早期的病毒作为扩增源。比如，用第2 代病毒产生第3 代病毒。如果没有第2 代病毒，那么必须用第1代病毒来产生新的第2 代病毒。按这个原则进行扩增可使RCA 水平尽可能低。

如果用于表达蛋白，则可以收集细胞后根据蛋白特点选择适当方法抽提蛋白。细胞沉淀中一般可提取1-5mg蛋白，建议在小规模扩增后先测定感染后抽提蛋白的最佳时间，然后再大量扩增蛋白。

腺病毒扩增

第一代		第二代	第三代	第四代
每瓶细胞数	1×105	5×106	1×107	1×107
培养瓶大小（cm2）		75	175	175

 

培养瓶数	24 孔板1 孔	1	3	30
		首次扩增后的病
感染来源	稀释的空斑		第二代病毒	第三代病毒
		毒保存液
		0.5 mL 或
每瓶接种量	0.1 mL		1 mL	1.5 mL
		2.5×107
总培养体积	1 mL	10 mL	90 mL	900 mL
MOI	0.01	5	25	25
滴度（VP/mL）	1×108～9	5×108～9	3.3×108～9	3.3×108～9
总病毒量	1×108～9	5×109～10	3×1010～11	3×1011～12